蛋白质组学

方法介绍

      蛋白质组学使用高通量的检测技术对细胞、组织或生物体表达的全部蛋白进行定性和定量分析，其终极目标是解析生物体内所有蛋白质的存在状态。根据研究深度的不同，可以将蛋白质组学研究分为以下几个层次：

1、蛋白鉴定和序列验证：使用质谱和其他生化技术对样品中蛋白质的种类及其氨基酸序列进行分析、鉴定和验证；
2、蛋白定量分析（丰度分析）：对同一个样本中或不同样本间（野生型 vs. 突变体或者处理组 vs. 对照组）蛋白表达的相对丰度和绝对含量进行分析；
3、蛋白翻译后修饰位点鉴定：对蛋白翻译后修饰的种类和发生位点进行分析和鉴定；
4、蛋白互作体鉴定：使用Co-IP、蛋白交联等技术，结合质谱技术鉴定蛋白互作和蛋白复合体。

       基于质谱的蛋白质组学研究包括“自上而下”（top-down）和“自下而上”（bottom-up）两条技术路线。Top-down路线使用质谱分析完整蛋白质，获得其质荷比信息并计算蛋白质的分子量。完整蛋白离子在质谱仪中发生碰撞诱导碎裂，通过分析蛋白碎片的质荷比，并进一步确定蛋白碎片的分子量和氨基酸序列，可以将蛋白片段的序列信息拼接成完整蛋白质的序列信息。Top-down路线需要富集和纯化完整蛋白质，主要用于研究蛋白翻译后修饰和蛋白复合体等，对于水溶性较差的膜蛋白和低丰度蛋白的检测较为困难。在测定分子量较大的蛋白质时，对质谱仪的质量扫描范围、灵敏度和分辨率也有较高要求。Top-down实验通常需要使用超高分辨的轨道阱质谱仪或FT-ICR质谱仪。

       Bottom-up技术路线不预先分离和纯化蛋白质，而是使用特异性蛋白内切酶将蛋白酶解成一系列多肽片段。然后，使用液相色谱分离多肽混合物，再使用质谱测定这些多肽离子的质荷比，并将多肽离子碎裂成碎片离子，并采集多肽碎片离子的二级质谱图。最后使用数据库搜索软件对多肽的二级质谱图进行氨基酸序列匹配和蛋白鉴定。获得蛋白质序列信息后，还可以对蛋白的翻译后修饰位点、表达量等进行进一步分析。

       Bottom-up路线使用蛋白内切酶将复杂蛋白混合物酶解成多肽片段，就像用霰弹枪（shot-gun）将蛋白击碎，因此自下而上的蛋白质组学技术路线又被称为shot-gun proteomics（鸟枪法、霰弹法）。Bottom-up法可以直接分析复杂的蛋白混合物，免除蛋白纯化的流程，样品处理过程更简单。将蛋白酶解成肽段后再进行分析，还解决了膜蛋白水溶性差、难于提取和处理的问题。难溶于水的膜蛋白经过蛋白酶水解后，得到的多肽片段通常都具有较好的水溶性，便于后续的色谱分离和质谱鉴定。蛋白酶解后得到的多肽片段分子量通常小于3 kDa，非常适于使用质谱测定其质荷比。如果质谱鉴定到的多肽的氨基酸序列是某个蛋白质特有的氨基酸序列，就可以由此确认样品中该蛋白质的存在，而无需鉴定该蛋白质的全部氨基酸序列。“鸟枪法”技术路线是目前蛋白质组学研究中最常用的技术路线。

“鸟枪法”蛋白质组学实验的流程

1、蛋白提取：使用蛋白裂解液、尿素等将目标蛋白从细胞、组织或体液中提取出来，可以使用丙酮沉淀等方法对提取的蛋白进行净化。进一步，可以使用免疫共沉淀等方法将目标蛋白富集，使用SDS-PAGE对目标蛋白进行预分离；
2、蛋白酶解：使用特异性蛋白内切酶对目标蛋白进行酶解，通常使用胰蛋白酶，特殊情况下可以选择Lys-C、Asp-N、Chymotrypsin等蛋白酶；
3、色谱分离和质谱检测：使用纳升液相色谱对多肽进行分离，亲水性多肽洗脱速度快，疏水性多肽洗脱慢；使用高分辨质谱检测多肽的分子量和碎片信息；
4、数据分析：使用数据库搜索软件对质谱采集的数据进行蛋白序列匹配和蛋白定量。





      简单的蛋白质组学实验可以鉴定SDS-PAGE条带中的“目标”蛋白条带是否符合预期、鉴定Co-IP实验发现的互作蛋白、确定蛋白翻译后修饰位点。复杂的蛋白质组学实验则可以对几百甚至上千个组织、细胞或者血液样品进行深度蛋白质组分析，对其中超过一万种蛋白质的表达量进行比较，寻找不同疾病或不同生理状态下细胞/组织中蛋白表达的差异，为研究疾病的致病机理，药物的治疗机理寻找目标。

送样要求：

       SDS-PAGE条带（考染或银染），需有肉眼可见的清晰条带。蛋白溶液，需明确标注蛋白的浓度和使用缓冲液的组成和浓度，不得含有SDS、RIPA、CHAPS和Triton等表面活性剂。大规模定量蛋白质组学实验需要1×107个细胞或10 mg以上的组织。蛋白翻译后修饰位点鉴定通常需要对修饰后的蛋白或者肽段进行富集，需要使用富集（抗体）小柱，送样前请联系生物质谱中心确认。如需使用胰蛋白酶之外的特殊蛋白酶，送样前请联系生物质谱中心确认。

实验结果：

质谱中心会将实验结果以电子邮件形式发送到用户的注册邮箱中，实验原始数据保存在计算中心数据存储服务器上，用户可以按需下载。